In questi stessi anni un genetista statunitense, George W. Beadle, che stava lavorando sui mutanti di Drosphila per il colore degli occhi, formulò l'ipotesi che i diversi colori degli occhi osservati in questi mutanti fossero il risultato della variazione di un unico enzima. Nel 1941 Beadle insieme a Edward L. Tatum, riuscì a dimostrare a dimostrare la relazione fra mutazioni e perdita di funzionalità specifiche di enzimi. Sulla base di tali risultati giunsero alla conclusione che a particolare gene corrisponde un determinato enzima.
Quando si vide che molte proteine sono formate da più di una catena polipeptidica, l'espressione venne corretta ancora una volta in una forma meno facile da ricordare, ma più precisa: un gene-una catena polipeptidica.
Un'ulteriore modificazione a questa ipotesi fu introdotta quando si scoprì che alcuni geni possono codificare, cioè portare l'informazione genetica, per la sintesi di non catene proteiche, ma di molecole di RNA. I geni che codificano per una catena polipeptidica o per un determinato RNA vennero chiamati geni strutturali per distinguerli dai geni che vengono detti regolatori.
Linus Pauling fu uno dei primi a cogliere le implicazioni del lavoro di Beadle e Tatum, pensava: le malattie che riguardano l'emoglobina, come l'anemia falciforme, possono essere ricondotte a una variazione, rispetto alla norma, della struttura proteica della molecola di emoglobina. Per verificare la sua ipotesi Pauling prelevò campioni di emoglobina da individui affetti da anemia falciforme e dunque omozigoti recessivi, da individui eterozigoti per l'allele dell'anemia e da individui omozigoti per l'allele normale,si servì di una tecnica, detta elettroforesi, che permette di osservare il comportamento di molecole organiche disciolte in una soluzione e sottoposte all'azione di un debole campo elettrico. Anche se le molecole sono di grosse dimensioni, vi possono essere piccolissime differenze di carica; in un campo elettrico queste differenze fanno muovere la molecola a velocità diverse. L'emoglobina normale ha una maggiore carica negativa, per cui rimane più vicina al polo positivo rispetto all'emoglobina delle cellule falciformi. L'emoglobina presente in un individuo eterozigote mostrava invece una curva con due picchi,corrispondenti all'emoglobina normale e a quella delle cellule falciformi: ciò dimostra la presenza di entrambe le forme di emoglobina.
IL RUOLO DELL'RNA
Grazie anche alle ricerche di Pauling fu chiaro che la molecola di DNA è il codice che contiene le istruzioni per la sintesi delle strutture e per le varie funzioni cellulari, e che queste istruzioni sono poi eseguite dalla proteine.
La sequenza lineare degli amminoacidi di una catena polipeptidica determina la struttura tridimensionale dell'intera proteina, e questa struttura a sua volta ne determina la funzione.Il problema successivo divenne quello della traduzione. L'acido ribonucleico (RNA) è una sostanza chimicamente simile al DNA, vi sono tre differenti tipi di RNA e DNA.
Diverse ricerche portano a concludere che l'RNA avesse un ruolo importante nella traduzione dell'informazione genetica, ossia nel processo che traduce le sequenze dei segmenti di DNA nelle esatte sequenze di amminoacidi che determina le precise strutture proteiche. Un risultato di tali ricerche fu la scoperta che le cellule molto ricche di RNA sintetizzano grandi quantità di proteine; nelle cellule eucariote l'RNA si trova essenzialmente nel citosol, sia le cellule procariote sia quelle eucariote in grado di produrre grandi quantità di proteine hanno numerosi ribosomi, i quali sono ricchi di RNA.
Quando una cellula batterica viene infettata da un virus che contiene DNA, dal DNA virale viene sintetizzato l'RNA prima che cominci la sintesi proteica. Alcuni virus non possiedono DNA e sono per tanto costituiti soltanto da RNA e proteine; l'RNA contiene informazioni sulla struttura proteica; tre tipi di RNA agiscono come intermediari nei processi che portano alla sintesi nel citosol delle diverse proteine. Il primo di questi tipi di RNA è l'RNA messaggero.
Le molecole di RNA messaggero (mRNA) sono assemblate a partire da uno dei due filamenti del DNA in base allo stesso principio dell'appaiamento delle basi azotate che regola la sua duplicazione. Come un filamento di DNA, ogni molecola di RNA ha un'estremità 5' e 3'. I nucleotidi si aggiungono alla catena di RNA in via di formazione perdendo due gruppi fosfato.Questo processo di sintesi dell'RNA, conosciuto come trascrizione, ha lo scopo di trascrivere il messaggio contenuto in un segmento di DNA in una molecola di RNA complementare; per questo motivo tale molecola è chiamata trascritto.
Particolari sequenze nucleotidiche del DNA, dette pormotori, sono i siti di legame per l'enzima RNA polimerasi; nel punto di attacco di questo enzima, il DNA si apre e i due filamenti continuano a separarsi mano a mano che l'RNA polimerasi si sposta lungo la molecola.
I nucleotidi sono assemblati nell'RNA in direzione da 5' a 3'via via che l'enzima "legge"il filamento stampo di DNA in direzione inversa da 3' a 5'. I promotori costituiscono il segnale di partenza per la sintesi dell'RNA, mentre altre sequenze chiamate sequenze di arresto, o terminatrici, bloccano la sintesi dell'RNA.
L'RNA messaggero è una molecola che ha il compito di trasportare nel citoplasma le informazioni codificate nel DNA; per svolgere questo incarico deve essere assemblato senza errori e attraversare la membrana nucleare per dirigere la sintesi della sequenza di amminoacidi del polipeptide corrispondente. Quando il suo compito è terminato, l'RNA messaggero si scompone nei nucleotidi che lo costituiscono, i quali poi saranno di nuovo disponibili per la sintesi di altre molecole di mRNA.
Il processo di trascrizione può essere suddiviso in tre fase: inizio, allungamento e terminazione.
- Nella fase di inizio l'RNA polimerasi riconosce la sequenza del promotore e si attacca a esso; in molti batteri la formazione del legame è favorita da una proteina chiamata "fattori sigma". Questa fase è completata quando vicino al promotore i filamenti di DNA vengono separati formando così un complesso aperto lungo una dozzina di basi azotate.
- Durante la fase di allungamento l'RNA polimerasi sintetizza il trascritto di mRNA e il fattore sigma di solito si stacca. Il filamento di DNA che viene trascritto viene chiamato filamento stampo; la sequenza di basi del filamento di RNA in via di formazione è complementare, e non identica, al filamento stampo da cui viene trascritta; la sua sequenza è, invece, identica al filamento di DNA non trascritto, tranne che la timina è sostituita dall'uracile.
- Nella fase finale, ossia quella di terminazione, l'RNA polimerasi incontra sul DNA una sequenza di arresto costituita da nucleotidi che bloccano il processo di trascrizione.
I geni codificanti per le proteine sono interrotte da sequenze nucleotidiche che non vengono tradotte. Queste interruzioni non codificanti di un gene sono dette introni, mentre le sequenze codificanti sono chiamate esoni. Gli introni furono scoperti nel corso degli esperimenti di ibridazione mRNA-DNA; questa tecnica si basa sul fatto che due filamenti singoli di acidi nucleici differenti tendono ad appaiarsi per formare un doppio filamento solo nei tratti in cui le loro basi azotate risultano complementari. Se si scalda una doppia elica di DNA, i suoi due filamenti tendono a staccarsi per rottura dei legami a idrogeno: si dice che il DNA si denatura; prendendo uno dei due filamenti denaturati e raffreddandolo in presenza di un filamento di mRNA, si può giudicare quanto questi due acidi nucleici siano simili in base alla lunghezza dei tratti che si appaiano.
Grazie a questa tecnica, i ricercatori scoprirono che non vi era una perfetta corrispondenza fra le molecole di RNA messaggero maturo, ossia quello che giunge nel citosol e partecipa alla sintesi delle proteine, e i geni da cui queste molecole venivano trascritte; le sequenze nucleotidiche dei geni erano molto più lunghe delle molecole complementari di mRNA maturo.
Gli introni possono essere trascritti inizialmente nelle molecole di RNA non ancora elaborate, ma i segmenti di mRNA corrispondenti agli introni sono eliminati prima della traduzione. Le sequenze complementari di DNA e di mRNA sono tenute insieme da legami a idrogeno. Alcuni segmenti di DNA non hanno segmenti di mRNA corrispondenti e così formano delle anse esterne alla sequenza ibridata; queste anse sono i sette introni. Dal punto di vista evolutivo non è ancora chiaro se gli introni siano comparsi nel corso del tempo, o viceversa, fossero presenti anche nelle prime cellule; secondo quest'ultima ipotesi, più accreditata, i batteri e gli altri microrganismi che hanno un alto tasso di riproduzione avrebbero eliminato col passare del tempo tutto il DNA considerato inutile.
Prima che la trascrizione sia completata, in genere quando il filamento di mRNA in via di formazione è lungo una ventina di nucleotidi, viene aggiunto un "cappuccio" di un insolito nucleotide alla sue estremità 5'; questo processo viene chiamato di capping. Il cappuccio è necessario per far uscire l'mRNA dal nucleo e per attaccarlo al ribosoma eucariote.
Completata la trascrizione, il pre-mRNA va incontro ancora a due processi prima di passare nel citosol: la sua trasformazione in mRNA maturo e l'aggiunta di una sequenza nucleotidica all'estremità 3' della molecola. Questa aggiunta consiste in una catena lunga fino a 200 nucleotidi contenenti tutti la base azotata adenina. Questo nuovo segmento, chiamato coda poli-A, ha lo scopo di conferire una certa stabilità alla molecola consentendole di resistere per un tempo maggiore nel citosol.
L'altro importante evento che avviene prima che la molecola di pre-mRNA lasci il nucleo è lo splicinig, un meccanismo tramite cui avviene il tagli degli introni e la ricongiunzione degli esoni: i due introni vengono eliminati e gli esoni sono saldati insieme in sequenza per formare un'unica molecola continua. Gli introni vengono rimossi dal trascritto di mRNA da un grosso complesso molecolare che prende il nome di spliceosoma ed è formato da numerose subunità chiamate snRNP. Lo splicing deve essere assai preciso dato che il più piccolo errore potrebbe avere conseguenze molto gravi per la cellula. L'mRNA maturo passa poi nel citosol dove è tradotto in proteina.
Nelle cellule eucariote, i trascritti di pre- mRNA identici vengono rielaborati in modi diversi per cui, da un singolo gene, si possono formare molteplici mRNA maturi (splicing alternativo); ciò permette a un gene di codificare per due o più proteine.
Un esempio delle conseguenze dello splicing alternativo a partire dallo stesse segmento di DNA è il processo di maturazione della molecola di mRNA in cellule di due diverse ghiandole, la tiroide e l'ipofisi. Queste ghiandole producono diversi ormoni a struttura peptidica tra cui la calcitonina e il CGRP che regolano il contenuto del calcio nelle ossa. Nella ghiandola tiroidea vengono rimossi all'inizio del processo i segmenti E e F e viene aggiunta la coda poli-A al'estremità dell'esone D; gli introni vengono poi rimossi e la molecola matura di mRNA è tradotta nell'ormone peptico calcitonina. Invece, nell'ipofisi la coda poli-A si attacca all'estremità dell'esone F; da questo trascritto vengono rimossi cinque introni, tra cui il segmento D che nella tiroide veniva trattenuto come esone.
IL CODICE GENETICO
Un codice è un sistema di segnali o simboli ai quali viene attribuito un significato preciso allo scopo di trasmettere un messaggio; nel caso del codice genetico, il messaggio contenuto nel DNA deve essere codificato per sintetizzare le proteine. Gli scienziati, per capire come la sequenza nucleotidica del DNA potesse contenere le istruzioni per la sintesi di strutture tanto diverse come le proteine, affrontarono il problema con gli stessi metodi che i crittografi usano per decifrare i codici. Ogni combinazione è costituita da una sequenza di tre nucleotidi (tripletta) che viene chiamata codone.
Gli scienziati che eseguirono i primi fondamentali esperimenti per decifrare il codice furono Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei.
L'RNA messaggero si dimostrò lo strumento più idoneo per decifrare il codice. Nirenberg prese estratti cellulari di E.coli a cui aggiunse amminoacidi marcati radioattivamente e campioni di RNA prelevati da diversi organismi. Tutti i campioni di RNA stimolavano la sintesi proteica e le quantità di proteine radioattive prodotte erano piccole, ma misurabili; i dispositivi cellulari producevano proteine anche quando gli "ordini" ricevuti dall' RNA provenivano da organismi estranei.
Nirenberg e Matthaei provarono poi a inserire un RNA artificiale: se gli estratti di E. coli potevano leggere un messaggio estraneo e tradurlo in proteine, essi avrebbero forse potuto leggere anche un messaggio del tutto inventato dagli stessi scienziati.
Severo Ochoa aveva sviluppato un metodo per sintetizzare un lungo filamento di RNA mediante l'unione di nucleotidi; con questa tecnica egli aveva prodotto in una provetta un RNA che conteneva soltanto una base azotata, un uracile, ripetuta più volte. Questa molecola fu chiamata "poli-U".
Nienberg e Matthaei prepararono 20 provette differenti, ognuna delle quali conteneva estratti cellulari di E.coli in cui erano presenti i ribosomi, l'ATP, gli enzimi necessari e tutti gli amminoacidi. In ogni provetta uno degli amminoacidi era marcato radioattivamente. A ciascuna provetta fu aggiunto l'RNA poli-U. In 19 provette non si produsse alcun polipeptide radioattivo, ma nella ventesima, in cui era stata aggiunta la fenilalanina radioattiva, i ricercatori poterono osservare la formazione di catene polipeptidiche radioattive. Analizzando i polipeptidi, si vide che essi erano costituiti da catene di un solo amminoacido, la fenilalanina. Nienberg e Matthaei avevano dato il messaggio "uracile-uracile-uracile" e ad esso era seguita una risposta: fenilalanina.
Dalle 64 possibili combinazioni di triplette, 61 determinano specifici amminoacidi e tre sono segnali di arresto. Essendoci 61 combinazioni codificanti per solo 20 amminoacidi, è chiaro che molti amminoacidi devono avere più di un codone.
Il codice genetico è identico praticamente in tutti gli organismi. Si è evoluto in tempi remoti ed è rimasto invariato e rappresenta l'unità base di tutti gli esseri viventi.
LA SINTESI PROTEICA
Negli organismi eucarioti i meccanismi con cui avviene la sintesi proteica sono più complessi: una caratteristica fondamentale che riguarda gli eucarioti è che la trascrizione ha luogo all'interno nel nucleo della cellula, mentre le proteine sono sintetizzate nel citoplasma.
La sintesi delle proteine richiede, oltre all'mRNA, altri due tipi di RNA: l'RNA ribosomiale e l'RNA di trasporto. Queste molecole che vengono trascritte nei propri geni presenti nel DNA della cellula, differiscono dall'RNA messaggero sia per la struttura sia per la funzione.
I ribosomi sono i siti della sintesi proteica e sono costituiti per 1/3 da proteine e 2/3 da RNA; il tipo di RNA che essi contengono è detto RNA ribosomiale (rRNA). Ogni ribosoma è formato da due subunità, ognuna composta da rRNA e proteine specifiche.
- la subunità più piccola, detta subunità minore, ha un sito di legame per l'RNA messaggero;
- la subunità più grande, o subunità maggiore, ha tre siti di legame per gli RNA di trasporto.
UN secondo sito di attacco si trova u uno dei "bracci" della molecola; questo sito è costituito da tre nucleotidi che formano un anticodone, complementare a uno specifico codone dell'mRNA.
UN'altra regione della molecola di tRNA funziona come sito ri riconoscimento per un enzima chiamato "amminoacil-tRNA sintetasi". In ogni cellula vi sono almeno 20 diverse amminoacil-tRNA sintetasi; ognuno di questi enzimi ha un sito di legame per un dato amminoacido e per la relativa molecola di tRNA. Le amminoacil-tRNA sintetasi, grazie all'energia liberata dal processo di idrolisi dell'ATP, catalizzano l'attacco degli specifici amminoacidi alle relative molecole di tRNA; in questo modo l'amminoacido è pronto per essere trasportato in un punto preciso della catena polipeptidica in via di formazione.
La sintesi proteica è detta traduzione, così come la trascrizione si svolge in tre fasi: inizio, allungamento e terminazione.
la prima fase, l'inizio, comincia quando la subunità minore del ribosoma si attacca al filamento di mRNA presso l'estremità 5', ponendo in evidenza il primo codone. Nei procarioti l'estremità iniziale dell'mRNA si attacca al ribosoma anche se il resto della molecola è ancora in fase di trascrizione; nei procarioti,a differenza degli eucarioti, trascrizione e traduzione possono avvenire contemporaneamente.
Il primo tRNA si colloca in modo da appaiarsi al codone di inizio dell'mRNA. Questo codone è in genere 5'-AUG-3'. Nei procarioti il tRNA che ah questo anticodone porta con sé una forma modificata dell'amminoacido metionina. La combinazione fra subunità minore, l'mRNA e il tRNA d'inizio è detta complesso iniziale; la subunità maggiore si attacca a quella minore e il tRNA di inizio va occupare il sito P della subunità maggiore. L'energia necessaria per questa tappa viene fornita dall'idrolisi del nucleotide guaninosina trifosfato (GTP).
All'inizio della seconda fase, quella di allungamento, il secondo codone di mRNA si trva in corrispondenza del sito A della subunità maggiore. Un tRNA con con l'anticodone complementare si inserisce sulla molecola di mRNA e, con il suo amminoacido, viene a occupare il sito A del ribosoma. A questo punto entrambi i siti A e P sono occupati e si forma un legame peptidico tra i due amminoacidi.
L'mRNA poi scorre in avanti di un codone del ribosoma; di conseguenza: il prmo tRNA si aposta nel sito E e viene liberato; il secondo tRNA, al quale sono attaccati i due amminoacidi, passa dal dito A al sito P; un terzo complessi amminoacido-tRNA, si inserisce nel sito A.
All'estremità finale del filamento di mRNA è presente uno dei tre codone che portano il segnale di arresto. Non esistono tRNA con anticodoni corrispondenti a queste triplette di stop, durante la fase di terminazione nel sito A non entrerà alcun tRNA, ma inserirà una proteina detta fattore di rilascio.Quando si giunge a un codone di terminazione, a traduzione cessa, la catena polipeptidica viene rimossa e le due subunità ribosomiali si separano.
LE MUTAZIONI GENETICHE
Il botanico olandese Hugo de Vries definì le mutazioni come caratteristiche che appaiono nel fenotipo, la definizione è differente e si riferisce al genotipo: una mutazione è un cambiamento della sequenza o del numero dei nucleotidi in un segmento di acido nucleico. Le mutazioni che si verificano nei gameti, o nelle cellule che danno origine ai gameti, sono trasmesse alle generazioni successive; le mutazioni che si verificano nelle cellule somatiche sono trasmesse anche alle cellule figlie. Molte mutazioni riguardano la semplice sostituzione e sono dette mutazioni puntiformi.
Esistono diversi tipi di mutazioni: una mutazione che determina l'inserimento di un amminoacido è detta mutazione di senso (anemia falciforme).
Un altro tipo di mutazione puntiforme viene definito mutazione non senso, in tal caso il risultato della sostituzione di un nucleotide è un codone di arresto,ciò provoca la fine della sintesi proteica prima che sia stato tradotto l'intero polipeptide (distrofia muscolare di Duchenne).
Un terzo tipo di mutazione puntiforme è la mutazione silente che si verifica quando al cambiamento di un nucleotide non corrisponde un cambiamento di amminoacido nel momento della traduzione e non si hanno conseguenze di alcun tipo sull'individuo.
Le mutazioni possono essere spontanee o indotte.
Le mutazioni spontanee possono derivare dall'azione di sostanze tossiche che provengono dai processi metabolici della cellula, come i radicali liberi, interagiscono direttamente col DNA alterandone la struttura. Il tasso di mutazioni spontanee in genere è basso;
Molte mutazioni sono invece indotte, ossia avvengono per cause ambientali; tra gli agenti che provocano questo tipo di mutazioni ci sono i raggi X, i raggi ultravioletti, i materiali radioattivi e varie sostanze chimiche chiamate, nel loro complesso, mutageni.
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